Biokatalyyttiset kaskadit mahdollistavat makrosyklisen peptidin Enlicitiden valmistuksen

MSD:n tutkittava oraalinen PCSK9-inhibiittori, enlisitididekanoaatti (MK-0616), on ensimmäinen suun kautta otettava makrosyklinen peptidi-PCSK9-inhibiittori, joka on osoittanut merkittävää LDL-kolesterolin alentamista ihmisillä. Enlisitidi kehitettiin monosyklisten peptidien mRNA-näyttöruudusta ja sen jälkeen stabiloitiin ei-peptidisillä ristisidoksilla kolmen fuusioidun makrosyklin käsittävän rakenteen muodostamiseksi. Tämä monimutkainen oktapeptidi sisältää kuusi luonnotonta ja kaksi proteiinia aiheuttavaa aminohappoa, jotka on yhdistetty 12 amidisidoksella ja keskeisellä kuuden hiiliketjun linkkerillä. Perinteinen kemiallinen synteesi vaatii 43 vaihetta, suojaryhmien käsittelyä (lähes puolet synteettisistä vaiheista), kromatografisia puhdistuksia ja erittäin laimean ruteenin katalysoidun renkaan sulkemisen metateesivaiheen, mikä rajoittaa skaalautuvuutta ja kestävyyttä.

Kemoentsymaattisen valmistuksen kehitys

MSD:n tutkijat kehittivät tiiviin ja konvergentin kemoentsymaattisen prosessin enlisitididekanoaatin (1) valmistamiseksi, joka mahdollisti monomeerien suoran kytkemisen aminohappoligaasien avulla, yhdistettynä biokatalyyttiseen peptidifragmenttien ligaatioon ja makrosyklisointeihin käyttämällä esteraaseja ja imiinireduktaaseja.

Tärkeimmät saavutukset

Kolmen entsyymin kaskadikokoonpano käyttäen ATP-tartu-ligaaseja

- Kolmen entsyymin kaskadi (kaksi muokattua ATP-grasp-ligaasia + ATP-kierrätys) kokoaa tetrapeptidin suojaamattomista aminohapoista. ATP-haarukkaligaasit (erityisesti ATP-riippuvaiset aminohappoligaasit, AAL:t) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat amidisidoksen muodostumista suojaamattomien aminohappojen tai peptidien välillä käyttämällä ATP:tä energialähteenä. Niiden mekanismi etenee seka-anhydridivälituotteen kautta, mikä mahdollistaa suoran kytkennän tarvitsematta suojaryhmiä nukleofiilisessä amiinissa tai aktivoiduissa asyyliluovuttajissa. Tässä tutkimuksessa tutkijat käyttivät Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) -bakteerin ATP-tartu-ligaasia ja muokattuja variantteja (Trp-BaAALEng ja Phe-BaAALEng) laajentamaan selektiivisesti dipeptidiä kahdella ei-luonnollisella aminohapolla (tryptofaani ja fenyylialaniinianalogit) yhden astian kaskadissa. Näillä ligaaseilla on kapea, haudattu elektrofiilitasku, joka hyväksyy yksittäiset aminohapot elektrofiileiksi (C-terminaaliset substraatit), mutta voi sisältää pidempiä peptidejä N-nukleofiileina. Tämä selektiivisyys tekee niistä ihanteellisia peräkkäiseen, suojaryhmistä vapaaseen peptidikokoonpanoon C-päästä N-päähän. Kulutettu ATP kierrätetään käyttämällä polyfosfaattikinaasia (FbPPKWT) ja edullista heksametafosfaattia fosfaatin luovuttajana.

Suunniteltu esteraasin (RsEstEng) regioselektiivinen makrolaktamointi

- Muokattu esteraasi (RsEstEng) katalysoi regioselektiivistä makrolaktamointia muodostaen Northern-fragmentin (73 %:n saanto, 52 kg:n mittakaava). RsEstEng on peräisin villityypin karboksyyliesteraasista (RsEst), joka on tunnistettu Roseibacillus sp. Sen luontainen tehtävä on esterisidosten hydrolyysi. Suunnatun evoluution avulla tutkijat muuttivat sen katalysaattoriksi regioselektiiviselle makrolaktamisaatiolle – makrosyklisen amidisidoksen muodostumiselle – enlisitidin pohjoisen fragmentin (4) synteesissä. Se hyväksyy lineaarisen tetrapeptidin (9) stabiilin, kookkaan tert-butyyliesterin asyyliluovuttajaksi makrosyklisen peptidin (4) tuottamiseksi molekyylinsisäisen amidisidoksen muodostamiseksi. Se saavutti selektiivisen syklisoinnin ilman havaittavia oligomeerejä ja vain 0,8 % esterihydrolyysin sivutuotetta, jopa aiemman entsymaattisen kaskadin korkean ionivahvuuden olosuhteissa.

Muokattu tioesteraasi (BlTEEng) molekyylien välinen ligaatio

- Suunniteltu tioesteraasi (BlTEEng) suorittaa pohjoisen (4) ja itäisen fragmentin (3) molekyylien välisen ligaation ilman epimerisaatiota. BlTEEng on modifioitu versio tioesteraasidomeenista (TE), joka on alun perin leikattu pois Brevibacillus laterosporuksen (BlTE) ei-ribosomaalisesta peptidisyntetaasista (NRPS). Villityypin tioesteraasit NRPS-järjestelmissä katalysoivat tyypillisesti makrosyklisaatiota tai lineaaristen peptidien vapautumista kantajaproteiinista tioesterisidoksen kautta. BlTE:n muokatut variantit osoittivat jonkin verran aktiivisuutta, mutta suosivat dimeerisiä sivutuotteita. Entsyymitekniikka siirsi entsyymiä katalysoimaan molekyylien välistä ligaatiota käyttämällä stabiilimpia isopropyylioksoestereitä luonnollisten, hydrolyyttisesti labiilien tioestereiden sijasta.

Neljän entsyymin kaskadipelkistävä aminointimakrosyklisointi

- Neljän entsyymin kaskadi (PsIREDEng, KsKREDEng ja kofaktorien kierrätysentsyymit StLDHWT, TvADHWT) saa aikaan pelkistävän aminointimakrosyklisaation, jolloin muodostuu bisyklinen diamiini (saanto 69 %, asteikko 46 kg). KsKREDEng on kehitetty ketoreduktaasi Kyrpidia sp. Se katalysoi bentsyylialkoholiyhdisteen (10) hapettumista ohimeneväksi aldehydiksi (11), joka riippuu NAD+:sta. PsIRED on imiinireduktaasi Pseudogymnoascus sp. Se on NADPH-riippuvainen. PsIREDEng katalysoi aldehydin (11) ja olemassa olevan amiinin pelkistävää aminointia muodostaen syklisen imiinin (12), jota seuraa pelkistys sekundääriseksi amiinimakrosykliksi (13). StLDHWT regeneroi NAD+:n hapetusvaiheessa pelkistämällä pyruvaatin laktaatiksi, kun taas TvADHWT regeneroi NADPH:n pelkistysvaihetta varten hapettamalla isopropanolin asetoniksi.

Lopullinen makrosyklisointi muokatun PBP-tioesteraasin kautta

- Kemiallinen kytkentä Western-fragmentin kanssa (2), jota seuraa muokattu penisilliiniä sitova proteiinitioesteraasi (SsPBP-TEEng), sulkee lopullisen makrosyklin korkealla konsentraatiolla (70 g/l) ylittäen tyypillisen laimennusrajoituksen (5 g/l perinteisessä synteesissä). Kokonaisprosessi sisältää kolme kaskadivaihetta, 7 muokattua + 3 apuentsyymiä, 39 %:n kokonaissaanto, usean kilogramman mittakaavan esittely, >99 % puhtaus, ei kromatografiaa eikä suojaryhmiä. Tämä työ tarjoaa kestävän, skaalautuvan suunnitelman monimutkaisten makrosyklisten peptidien valmistukseen, mikä vähentää dramaattisesti vaiheiden määrää ja hukkaa ja parantaa tehokkuutta ja potilaiden saatavuutta.