01 T&K-tausta ja haasteet
1.1 MK-0616:n lääkekehityksen tausta
Enlicitide Decanoate (tunnetaan myös nimellä MK-0616) on ensimmäinen täysin de novo suunniteltu oraalinen makrosyklinen peptidi-PCSK9-inhibiittori, joka on tarkoitettu matalatiheyksisen lipoproteiinikolesterolin (LDL-C) alentamiseen ja ateroskleroottisten sydän- ja verisuonisairauksien hoitoon.
Kuten yllä olevasta kuvasta näkyy, klassisia esimerkkejä tällä alalla ovat MK-0616:n lisäksi myös antibiootti vankomysiini (2), kemoterapeuttinen aine paklitakseli (3) ja syöpälääke eribuliini (4). Yhdisteiden 2 ja 3 monimutkaiset rakenteet tarkoittavat, että niiden todellinen synteesi perustuu edelleen luonnontuotteisiin perustuviin puolisynteettisiin menetelmiin; Sitä vastoin Eisai-tiimi saavutti yhdisteen 4 kokonaissynteesin yli 60 vaiheessa, mikä merkitsi virstanpylvästä polyketidiyhdisteiden synteesissä.
Mitä tulee MK-0616:een, sen kemiallinen rakenne on erittäin ainutlaatuinen: se on ensimmäinen molekyyli, joka on suunniteltu kokonaan tyhjästä (eikä luonnollisista lähteistä johdettu); Lisäksi päivittäisenä suun kautta otettavana PCSK9-inhibiittorina, joka on tarkoitettu sydän- ja verisuonitautien hoitoon mieluummin kuin onkologiaan tai infektioiden hoitoon, sen maailmanlaajuinen kysyntä ylittää huomattavasti tavanomaisten innovatiivisten lääkkeiden kysynnän, mikä edellyttää tuotantoa sadoista kiloista useisiin tonneihin.
1.2 Synteettiset haasteet ja strategiat
MK-0616:n molekyylinen monimutkaisuus asettaa tiukat vaatimukset prosessin kehitykselle.
Rakenteelliset ominaisuudet: Vaikka MK-0616 on peräisin makrosyklisestä peptidistä, joka on tunnistettu mRNA-näyttöteknologian seulonnalla, se sisältää 6 ei-kanonista aminohappoa (yhteensä 8 aminohappoyksikköä), 37-jäsenisen makrosyklin, ammoniumsuolasivuketjun (10) ja ei-peptidifragmentin (13), joka tekee peptidin täysin kiinteäksi tavanomaiseksi. tehotonta, kuten alla on kuvattu.
Keskeiset haasteet, joihin on vastattava
1、Polaaristen välituotteiden stabiilisuus (erityisesti ammoniumsuolafragmenttien kohdalla, joissa vastaioni on hallittava koko prosessin ajan)；
2、Suuren renkaan sulkemisen selektiivisyys (vaatii kokoonpanosekvenssin optimoinnin 10 lohkon välillä)；
3、Suurennushaasteet (vältä kromatografista puhdistusta; varmista milligrammasta kiloon mittakaavan läpijuoksu)；
Siksi, tutkijoiden ehdottama keskeinen päätös on seuraava：
1、hajota ja hallitse：Priorisoi "pohjoisen fragmentin" (17-jäseninen rengas, joka koostuu ei-kanonisista aminohapoista asemissa 5, 6 ja 7) rakentaminen ja yksinkertaista makrosyklistä katkaisustrategiaa retrosynteettisellä analyysillä (esim. valitsemalla amidisidos asemien 5 ja 8 välillä).
2、Päätteen sivuketjun esittely：Polaarinen ammoniumsuolafragmentti (10) on varattava viimeistä asennusvaihetta varten, jotta vältetään välipuhdistukseen liittyvät haasteet.
3、Hapon joustava käyttö–emäksen neutralointireaktiot (RCM)：Asemiin 7 muodostuu n-heksaani-sidottu ketju–13; tällä reaktiolla on erinomainen ortogonaalisuus ja se voidaan suorittaa useissa vaiheissa.
Tämän strategiasarjan avulla tutkijat ovat lopulta luoneet skaalautuvan synteettisen reitin, joka tasoittaa tietä kliiniselle arvioinnille.02
02 Synteettinen strategia ja optimointi
Analyyttisten tutkimusten avulla tutkijat suorittivat tärkeimmän makrosyklisen fragmentin (pohjoisen fragmentin) monivaiheisen, usean sukupolven optimoinnin ja optimoivat eteläisen fragmentin kokoonpanon lopputuotteen kanssa.
2.1 Pohjoisen segmentin usean sukupolven optimointi:
Ensimmäinen sukupolvi– 37 iteraatiota
Ei-kanonisten aminohappojen (esim. 3-hydroksiproliinin) synteesi tehokkuus on alhainen, koska se perustuu tehottomiin syklisointireaktioihin—kuten Dieckmannin kondensaatio—sekä kiraalinen resoluutio; lisäksi tämä prosessi vaatii useita suojaryhmän käsittelykierroksia ja useita kromatografisia puhdistuksia, kuten alla olevassa kuvassa on havainnollistettu.
Kaikki nämä tekijät rajoittavat kohdefragmenttien laajamittaista synteesiä.
Toisen sukupolven synkroninen järjestelmä
Biokatalyysin avulla saavutettiin läpimurto: ketonipelkistyksen (KRED) käyttöönotto mahdollisti erittäin tehokkaan ja stereoselektiivisen pelkistyksen.β-hydroksiesterit; lisäksi muokattua TrpB-entsyymiä käytettiin syntetisoimaan fluorattua tryptofaania, mikä eliminoi kiraalisen erottelun tarpeen. Tämän seurauksena synteesivaiheiden lukumäärä väheni ja suojaryhmien käyttö minimoitui, kuten alla olevasta kuvasta ilmenee.
Tätä synteettistä reittiä pohjoisen fragmentin optimoimiseksi on sovellettu myös kliinisessä kehityksessä; Rakennestrategiasta johtuvat mahdollisuudet ovat kuitenkin luoneet tarpeen fragmenttisynteesipolun edelleen optimoinnille.
Ensinnäkin kolmea myöhäisen vaiheen kiteytysvälituotetta koskevat keskeiset havainnot tarjoavat kriittisen pisteen puhtauden hallinnassa; siksi on olennaista modifioida synteettistä reittiä näiden kolmen välituotteen sieppaamiseksi.
Toiseksi olefiinien syklotrimerointi on suositeltavaa suorittaa mahdollisimman myöhään synteesiprosessin aikana. Tämä lähestymistapa perustuu siihen, että ruteenikatalyytit voivat lisätä bentsotiuramiinituotannon kokonaiskustannuksia; tämän reaktion suorittaminen synteesireitin viimeisessä vaiheessa voi siten vähentää merkittävästi kustannuksia.
Siksi tämä on helpottanut kolmannen sukupolven lähestymistavan optimointia.
Kolmannen sukupolven yhteinen askeljärjestelmä
Entsymaattisella hydroksylaatiolla L-proliini hapetetaan suoraan 3-hydroksiproliiniksi, jonka stereoselektiivisyys ylittää 99:1; tunnistettiin tärkeimmät välituotteet, kuten bentseenisulfonaattisuolan kiteisyys, mikä mahdollisti kromatografisen puhdistuksen välttämisen; käytettiin modulaarista kokoonpanoa sekä aminohappokytkentäsekvenssin säätöjä ja suojaryhmästrategian yksinkertaistamista, kuten alla olevassa kuvassa on havainnollistettu.
Kolmannen sukupolven synteettinen MK-0616 Northern -fragmentti eroaa kahdessa edellisessä sukupolvessa syntetisoiduista fragmenteista. Tätä valintaa ohjasi kiteisen pentanoaatin 91 tunnistaminen, josta puuttuu treoniiniaminohappotähde (joka sisällytetään myöhemmin synteesin aikana). Tämä suola voidaan eristää suurella saannolla ja puhtaudella, ja se tarjoaa erittäin stabiilin välituotteen, jota voidaan varastoida keskeisenä välituotteena koko synteesiprosessin ajan.
Kolmannen sukupolven optimoinnin ansiosta juuri suunnitellun pohjoisen fragmentin (91) erottaminen vaatii nyt vain 14 vaihetta—vain kolmasosa ensimmäisen sukupolven synteesin vaiheiden määrästä. Lisäksi on tärkeää huomata, että kolmannen sukupolven protokollassa pisin lineaarinen sekvenssi on vähentynyt yli puoleen, ja se on laskenut 20 vaiheesta 9 vaiheeseen.
2.2 Eteläisen fragmentin optimointi
Ensimmäinen sukupolvi, jossa on 15 vaihetta
Alkaen kaupallisilta toimittajilta suuria määriä hankituista raaka-aineista, 9-vaiheinen prosessi edustaa pisintä lineaarista sarjaa, kuten alla olevasta kuvasta näkyy.
Toisen sukupolven synkroninen järjestelmä
Toisen sukupolven synteesissä parannettu ei ollut vaiheiden lukumäärä, vaan pikemminkin yleinen tehokkuuden ja puhtauden säätö, kuten alla olevassa kaaviossa esitetään. Tuhansien kokeiden jälkeen tunnistettiin Southern blot -fragmentti, jota kutsutaan leelamiinisuolaksi (99).
Näiden kahden yhdisteen käytön on aiemmin osoitettu toimivan ei-kiraalisina liuottimina karboksyylihapoille; näin ollen kiteinen suola (99) voidaan yllättäen saada erittäin puhtaana aineena, jolloin vältetään edellisessä synteesin sukupolvessa vaadittu laaja preparatiivinen HPLC-työ.
2.3 Tuotteen loppukokoonpano
Sekä ensimmäisen sukupolven pohjoinen fragmentti että eteläisen fragmentin toinen välituote voidaan helposti suojata, jolloin saadaan lineaarinen esiaste 61, kuten alla olevassa kuvassa esitetään; syklo-olefiinin metateesituotteen saanto on kuitenkin hyvin alhainen.
Siitä huolimatta tutkijat käyttivät menestyksekkäästi toista sekvenssiä, mikä mahdollisti ensimmäisen skaalautuvan MK-0616:n synteesin alla olevan kaavion mukaisesti.
Ensimmäisen sukupolven enaldehydisuolat syntetisoitiin 63-vaiheisella prosessilla, joka alkaa sivuketjujen asentamisella molekyyliytimeen korkeasaantoisella amidaatiolla, jota seuraa SFC-puhdistus; näistä vaiheista vaihe 28 edustaa pisintä lineaarista sekvenssiä.
Toisen sukupolven lopputuoteyhdistelmä on esitetty alla olevassa kuvassa.
Optimoimalla reittiä kohdetuotteeseen kohdistuville sekä pohjoisille että eteläisille fragmenteille, molemmat lähestymistavat voivat käyttää litteän fragmentin kiteisiä välituotteita synteesin viimeiseen vaiheeseen siirtymiseksi.
Tämä kytkentäreaktio on riittävän puhdas edetäkseen suoraan seuraavaan vaiheeseen käyttämällä raakareaktiota.
Kaiken kaikkiaan MK-0616:n toisen sukupolven synteettinen reitti vaatii 43 vaihetta, joista 21 vaihetta muodostavat pisimmän lineaarisen sekvenssin. Tämä sekvenssi vähentää sekä vaiheiden kokonaismäärää että pisimmän lineaarisen sekvenssin pituutta verrattuna ensimmäisen sukupolven prosessiin kolmanneksella.
03 Keskeiset teknologiainnovaatiot
Koko optimointiprosessin analyysi paljastaa useita innovaatioita avainteknologioissa, kuten:
1、Biokatalyysitekniikka:KRED dynaaminen kineettinen resoluutio; TrpB-entsyymivälitteinen tryptofaanianalogien synteesi; hydroksyyliryhmien suora lisääminen proliinihydroksylaasin kautta; jne.
2. Kiteytyslähtöinen puhdistus: Useita välivaiheita—kuten Northern blot -fragmenttien metyylisulfonaatti tai Southern blot -fragmenttien leelamiinisuola—Käytetään kiteytyspuhdistuksen aikaansaamiseksi, jolloin kromatografiakolonnien tarve eliminoituu.
3. Ortogonaalinen suojaryhmästrategia: joustava vaihto suojaryhmien, kuten Boc ja Nosyl, välillä monivaiheisten reaktioiden selektiivisyyden varmistamiseksi.
4. Vihreän kemian huomioita: raskasmetallikatalyyttien (esim. ruteniumkatalyyttien) käytön vähentäminen ja RCM-reaktion siirtäminen myöhempään vaiheeseen tuotantokustannusten alentamiseksi.
04 Yhteenveto ja näkymät
Tämä artikkeli osoittaa biokatalyysin ja kemiallisen synteesin joustavan yhdistämisen samalla, kun korostetaan kiteytysprosessien keskeistä roolia ja omaksutaan modulaarinen suunnittelulähestymistapa – esitellen siten systemaattista metodologiaa, joka ulottuu laboratoriotutkimuksesta teollisen mittakaavan tuotantoon. Tämä työ edustaa esimerkillistä tapausta monimutkaisen molekyylisynteesin alalla: vaiheiden kokonaismäärä pieneni ensimmäisen sukupolven protokollan 63:sta toisen sukupolven protokollaan 43:een, jolloin saannot kasvoivat lähes 1000-kertaisiksi ja mahdollistavat tonnin mittakaavan tuotannon toteutettavuuden. Koko prosessin ajan strateginen painopiste asetetaan kiteytysvaiheeseen, jolloin vältetään kromatografinen puhdistus – ominaisuus, joka tekee siitä erittäin sopivan tonnimittakaavaiseen tuotantoon. Lisäksi tämä tutkimus tarjoaa teknisen mallin muiden monimutkaisten makrosyklisten peptidien synteettisille lähestymistavoille.
